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任何HPLC或UHPLC柱都是有試用壽命的。正確使用和維護色譜柱可以延長其使用壽命,有利于該方法的經濟性。重要的是遵循*的色譜慣例,如適當的樣品制備(樣品應通過0.45µm的膜過濾器進行高效液相色譜過濾,通過0.22µm的過濾器進行超高效液相色譜過濾);流動相的適當質量/純度(例如,用于等度模式的等度級溶劑,用于梯度洗脫的梯度級溶劑);過濾流動相,發展良好的方法,具有足夠強的洗脫能力,以盡量減少非特定的吸附;與所選色譜柱兼容的溫度、pH值和最大背壓范圍。另外值得一提的是,總進樣次數與進樣體積成反比,例如,如果每次進樣10µL樣品,這導致柱壽命為5000次進樣,則每次進樣100µL的樣品負載增加通常會將柱壽命縮短至約500次進樣。
即使仔細遵循了上面列出的所有要點,用戶有時也會覺得色譜柱的使用壽命應該更長。為了找出如何延長色譜柱的壽命,首先需要了解是什么導致色譜柱老化。
一、顆粒污染/堵塞色譜柱:
來自流動相或樣品的任何顆粒材料都會污染色譜柱,一些顆粒也可能會遷移到柱填料中。這將導致柱背壓增加。這會給泵產生更多的應力,并可能導致柱沉降,形成空洞,從而導致峰值分裂。
二、非特定吸附:
高效液相色譜柱在使用過程中可能會遇到許多不同的物質,例如緩沖液中的鹽或流動相和樣品中的雜質。這些材料的保留率可能低于或高于分離的分析物。如果探測器觀察到這些不希望的干擾,則會出現鬼峰、斑點、基線干擾甚至負峰。吸收的雜質可能會對保留機制產生負面影響(縮短保留時間)或開始作為新的固定相(增加保留時間)。為這個主題提供的解決方案是什么?使用液相保護柱!保護柱將過濾所有顆粒,積累非特定吸附材料,還將延長在微堿性pH下使用的分析主柱的壽命。
三、壓力增大
每個顆粒填充柱包含一系列粒徑。粒度分布可能更寬或更窄。在色譜分析過程中,當非加壓注射回路連接到加壓柱時,柱將承受壓力應力。在這些壓力應力期間,塔填料受到沖擊,然后顆??赡芑Q位置,導致通常較大的顆粒上升(朝向塔入口),較小的顆粒下降(朝向塔出口)。在多次注射后,較小的顆粒將積聚在底部,而較大的顆粒將積聚在頂部。較小的顆粒區具有較高的堆積密度背壓,用戶將觀察到背壓穩步增加。這再次為儀器產生了更大的壓力,并可能導致色譜柱沉降,形成空隙,從而導致峰分裂。
許多客戶要求執行一些程序,將色譜柱重新生成到初始性能。因此,非常仔細地閱讀每一列隨附的說明書的重要性怎么強調都不為過。該表還包含有關建議的色譜柱保養和再生程序的信息。
然而,我們可以從理論上分析色譜柱再生的效率。通常,只有在色譜柱制造商允許的情況下,才可以通過反沖模式清洗色譜柱約5到20個色譜柱體積,輕松去除入口顆粒對液相色譜柱的污染。重要的是確保兩個柱狀熔塊(入口和出口)具有相同的孔隙率。請記住,被困在色譜柱填料深處的小雜質顆粒不太可能被清除。由于這種清洗,柱背壓應該有所降低。從色譜柱中去除非特定結合物質通常更為困難,結果通常不可預測,因為通常我們不知道這些污染物包含什么化合物。成功率可能在0%到100%之間。對于填充小于5µm顆粒的色譜柱,*恢復色譜柱填充均勻性的可能性很小。通常,柱反沖只在短時間內有效。